Biotechnologická laboratoř slouží k přípravě rekombinantních proteinů a monoklonálních protilátek pro imunizační, diagnostické a terapeutické účely.

Při přípravě požadovaných produktů jsou v závislosti na požadavcích využívány buď eukaryotické buňky (hmyzí buňky) nebo bakterie anebo pouze jejich specifické části či metabolity. Celý biotechnologický proces je rozdělen do dvou základních kroků – kultivace (tzv. upstream procesy) a následné zpracování a kontrola kvality produktu (tzv. downstream procesy).

Upstream procesy zahrnují kultivace buněk v bioreaktorech, včetně činností související s genetickým inženýrstvím, vývojem inokula, složením kultivačních médií a optimalizací kinetiky růstu za účelem navýšení exprese produktu. Pod downstream procesy rozumíme sklízení buněčné biomasy nebo kultivačního média z předcházejícího kroku, extrakcí proteinů fyzikálními (vysokotlaká homogenizace), chemickými nebo enzymatickými metodami. Následuje izolace a purifikace rekombinantních proteinů chromatografickými metodami (afinitní, iontově výměnná a gelová) pro přípravu výsledného produktu, který splňuje požadavky na čistotu a kvalitu.

UPSTREAM PROCESY

Tyto procesy označují první krok, ve kterém jsou biomolekuly kultivovány v bioreaktorech, a zahrnují všechny činnosti související s genetickým inženýrstvím, vývojem inokula, složením kultivačních médií a optimalizací kinetiky růstu za účelem navýšení exprese produktu. 

Po expanzi buněčných kultur do požadované hustoty v dané šarži jsou produkty sklizeny, přičemž v závislosti na lokalizaci produktu je v tomto procesu zachovávána buď buněčná biomasa – intracelulární produkce proteinu nebo kultivační médium v případě, že je produkt buňkami sekretován.

DOWNSTREAM PROCESY

Tyto procesy zahrnují zpracování sklizené buněčné biomasy nebo kultivačního média z předcházejícího kroku a následnou extrakci výsledného produktu tak, aby splňoval požadavky na čistotu a kvalitu.

Intracelulárně produkované rekombinantní proteiny musí být před jejich izolací a konečným zpracováním nejprve v maximální míře, avšak při současném zachování jejich biologické aktivity uvolněny z buněk do lyzačního roztoku. K tomuto účelu v naší laboratoři používáme různé fyzikální, chemické a enzymatické metody nebo jejich kombinace.

Fyzikální metody narušování buněk

Nejčastějšími fyzikálními metodami narušování buněčných stěn a biomembrán bakterií, resp. eukaryotických buněk za účelem uvolnění jejich intracelulárního obsahu jsou zejména ultrazvuk a vysokotlaká homogenizace (Microfluidizer). 

Chemické metody narušování buněk

Z chemických metodk denaturaci membránových proteinů a následné buněčné lyzi využíváme zejména detergenty iontové povahy, včetně kationt-cetyltrimethylamoniumbromidu a aniont-laurylsulfátu sodného. V některých případech a méně často jsou využívány i neiontové detergenty, které však oproti iontovým vykazují nižší reaktivitu, např. Triton X-100 nebo Tween. Obecně při použití detergentů vyvstává problém s následným čištění produktu a to zejména díky srážení solí. Toto omezení může být však překonáno použitím ultrafiltrace nebo iontoměničové chromatografie.

Enzymatické metody narušování buněk

Rozrušení buněk enzymatickými metodami má určité výhody, tj. k lýze buněk dochází za mírných podmínek selektivním způsobem. Nejčastěji používaný enzym v naší laboratoři je komerčně dostupný Lysozym. 

U gramnegativních bakterií se může použít lysozym ve spojení s EDTA. Pro lýzu buněčných stěn kvasinek se používáme glukanáua a mannanázu v kombinaci s proteázami.

KONCENTRACE PRODUKTU

K odstranění vody z buněčného lyzátu a koncentrování produktu se zachováním jeho biologických vlastností v naší laboratoři používáme techniky založené na odstřeďování a filtraci (tangenciální filtrace). Skutečně zvolený postup pak závisí jednak na jakostních a množstevních nárocích na finální produkt a současně na požadavcích na celkové náklady výroby.

PURIFIKAČNÍ CHROMATOGRAFIE

V laboratoři biotechnologií máme k dipozici různé typy chromatografických technik používaných pro separaci proteinů – afinitní, iontová výměna, gelová chromatografie.