Loading...

Laboratoř biotechnologie

Laboratoř biotechnologie

Biotechnologická laboratoř slouží k přípravě rekombinantních proteinů a monoklonálních protilátek pro imunizační, diagnostické a terapeutické účely. Její přístrojové vybavení umožňuje jak  optimalizaci produkce v 10 ml objemech, tak výrobu proteinů v uzavřených systémech od 1 do 10 litrů média.

Při přípravě požadovaných produktů jsou v závislosti na požadavcích využívány buď celé eukaryotické buňky nebo bakterie anebo pouze jejich specifické části či metabolity, přičemž celý biotechnologický proces je rozdělen do dvou základních kroků – kultivace (upstream procesy) a následné zpracování a kontrola kvality produktu (downstream procesy).

UPSTREAM PROCESY

Tyto procesy označují první krok, ve kterém jsou biomolekuly kultivovány v bioreaktorech, a zahrnují všechny činnosti související s genetickým inženýrstvím, vývojem inokula, složením kultivačních médií a optimalizací kinetiky růstu za účelem navýšení exprese produktu. 

Po expanzi buněčných kultur do požadované hustoty v dané šarži jsou produkty sklizeny, přičemž v závislosti na lokalizaci produktu je v tomto procesu zachovávána buď buněčná biomasa – intracelulární produkce proteinu nebo kultivační médium v případě, že je produkt buňkami sekretován.

DOWNSTREAM PROCESY

Tyto procesy zahrnují zpracování sklizené buněčné biomasy nebo kultivačního média z předcházejícího kroku a následnou extrakci výsledného produktu tak, aby splňoval požadavky na čistotu a kvalitu.

Intracelulárně produkované rekombinantní proteiny musí být před jejich izolací a konečným zpracováním nejprve v maximální míře, avšak při současném zachování jejich biologické aktivity uvolněny z buněk do lyzačního roztoku. K tomuto účelu v naší laboratoři používáme různé fyzikální, chemické a enzymatické metody nebo jejich kombinace.

Fyzikální metody narušování buněk

Nejčastějšími fyzikálními metodami narušování buněčných stěn a biomembrán bakterií, resp. eukaryotických buněk za účelem uvolnění jejich intracelulárního obsahu jsou zejména ultrazvuk a vysokotlaká homogenizace (Microfluidizer)

Chemické metody narušování buněk

Z chemických metodk denaturaci membránových proteinů a následné buněčné lyzi využíváme zejména detergenty iontové povahy, včetně kationt-cetyltrimethylamoniumbromidu a aniont-laurylsulfátu sodného. V některých případech a méně často jsou využívány i neiontové detergenty, které však oproti iontovým vykazují nižší reaktivitu, např. Triton X-100 nebo Tween. Obecně při použití detergentů vyvstává problém s následným čištění produktu a to zejména díky srážení solí. Toto omezení může být však překonáno použitím ultrafiltrace nebo iontoměničové chromatografie.

Enzymatické metody narušování buněk

Rozrušení buněk enzymatickými metodami má určité výhody, tj. k lýze buněk dochází za mírných podmínek selektivním způsobem. Nejčastěji používaný enzym v naší laboratoři je komerčně dostupný Lysozym. 

U gramnegativních bakterií se může použít lysozym ve spojení s EDTA. Pro lýzu buněčných stěn kvasinek se používáme glukanáua a mannanázu v kombinaci s proteázami.

KONCENTRACE PRODUKTU

K odstranění vody z buněčného lyzátu a koncentrování produktu se zachováním jeho biologických vlastností v naší laboratoři používáme techniky založené na odstřeďování a filtraci (tangenciální filtrace). Skutečně zvolený postup pak závisí jednak na jakostních a množstevních nárocích na finální produkt a současně na požadavcích na celkové náklady výroby.

PURIFIKAČNÍ CHROMATOGRAFIE

V laboratoři biotechnologií máme k dipozici různé typy chromatografických technik používaných pro separaci proteinů – afinitní, iontová výměna, gelová chromatografie.

Přístrojové vybavení

Down-stream procesy:

  • Centrifuga 5920R Eppendorf
  • Laminární boxy SAFE 1.8 biohazard - laminární box, vantianta HERASAFE (Thermo Fisher)
  • Termostat 37C, 5% CO2 (Thermo Fisher)
  • kultivační systémy: pro hmyzí buňky: Třepací inkubátor chlazený (28°C), New Brunswick Innova 43/43R, pro hmyzí a savčí buňky – Kývací bioreactor Biostat B 20 RM (Sartorius), pro bakterie, kvasinky E. coli - Fermentor (Solida Biotech)
  • kultivační systém pro produkci monoklonálních protilátek: miniPERM (Sarstedt) a FiberCell Systems (FiberCell Systems, Inc)
  • QuantStudio™ 3/5 (Thermo Fisher)

Up-stream procesy:

  • Ultracentrifuga Optima XPN-100 (Beckman Coulter)
  • Frakcionátor a gradientová stanice (Biocomp, Kanada)
  • Refraktometr Kruss Abbe AR4
  • Mikrofluidizer M-110L (Microfluidcs, USA)
  • Tangenciální filtrace KrosFlo TFF System KR2i (SpectrumLabs)
  • Tangenciální filtrace SartoflowSmart (Sartorius)
  • Ni- chromatografie
  • HPLC 1260 Infinity II (Agilent Technologies)
  • FFF (Agilent Technologies and Wyat Technology)
  • Philips 208s Electron Microscope Morgagni (FEI, Czech Republic)
  • Lyofilizátor
  • Automatická promývačka ELISA DYNAWASH (Dynex)
  • ELISA reader BioTek Synergy 2
  • Western blot system (Biorad)

Aktuální témata výzkumu

  • produkce chimerního rekombinatního antigenu VP1_PCV2_Cap v hmyzím expresním systému pro přípravu vakcíny a diagnostické účely proti prasečího cirkoviru
  • produkce monklonálních protilátek proti prasečímu cirkoviru pro diagnostické účely
  • produkce antigenů pro experimentální vakcíny proti Zika viru

Vedoucí laboratoře

Tým laboratoře